克隆形成实验colony forming assay

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

（1）、培养分选的两组细胞，取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。进行一代克隆形成率检测时，进入步骤（2）；进行二/三代克隆形成率检测，须再经此方法再培养一/二代，再取对数期细胞，进入步骤（2）。

（2）、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

（3）、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

（4）、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%

实验实例：

1、平板克隆形成：分别将阴性对照靶点和目的基因有效靶点慢病毒感染细胞，四天后，将处于对数生长期的细胞消化，计数后在6孔板培养板中接种500个细胞/孔，静置培养2周，中途隔3天换液并观察细胞状态，出现肉眼可见的克隆即终止培养，用多聚甲醛固定1h，再用Giemsa染色后，计数大于10个细胞的克隆。得到的实验结果如下：

  

实验结论：感染了目的基因靶点病毒的细胞，克隆形成能力减弱。