是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。

一、流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI 双染色法

原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），用流式细 胞仪即可检测凋亡细胞。细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏；Annexin V染色法不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V法更加省时，简单，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

实验步骤

(1) 用 PBS 洗细胞培养板两次，然后用胰酶消化，1000 rpm 离心 5 min，弃去培养液

(2) 各管加入 10 mL PBS，轻柔地悬浮细胞，洗细胞两次

(3) 计数1x105细胞放入100ul  1X Binding Buffer，放入1.5ml EP管

(4) ANNEXIN V 5ul先孵育20min，再加入PI 3ul 再孵10min，室温避光

(5) 加入400ul Binding Buffer,流式细胞仪分析细胞凋亡情况

诱导凋亡药物紫杉醇处理乳腺癌MCF7细胞8小时后，消化并收集细胞，用PBS洗涤细胞三次，加入annexin V-APC染色，流式细胞仪检测。 

二、TUNEL

基本原理：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
 

操作流程图：

 

实验步骤

（1）清洗：移去完全培养基，用 PBS 清洗一次细胞。 

（2）固定：用 4％的多聚甲醛在室温固定 15 分钟。 

（3）清洗：用 PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

（4）破膜：用含 0.1%Triton-X-100 的 PBS 在室温通透化处理 15 分钟。 

（5）清洗：用 PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

（6）封闭：用含 5%山羊血清（BSA）的 PBS 在室温封闭 1 小时。 

（7）清洗：TBST室温漂洗三次，每次10分钟。

（8）TUNEL溶液配制：Enzyme Solution和Label Solution以1：10混匀，避光备用，注意试剂用量，试剂盒价格昂贵，避免浪费。

（9）标记：用上诉配好的溶液，约20ul每张玻片，室温避光孵育10分钟，

（10）清洗：用PBS在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

（11）DAPI染核：加入 DAPI 染色液 1：2000 室温孵育 5 分钟。 

（12）清洗：用PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

（13）封片：用封片剂封片，在荧光显微镜下观察结果，免疫荧光照片用蔡司共聚焦显微镜。

（14）TUNEL positive dot 计算方法：DAPI和TUNEL positive dot 通过image pro软件，计算DAPI的阳性点作为细胞总数，TUNEL阳性点作为tunel点，最后计算 TUNEL/DAPI×100%作为凋亡细胞的比率。

实验结果图实例：