写在前面

       今天推荐的是由美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心团队在2018年12月13日发表于CancerResearch（IF：9.078 JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是SuyunHuang教授，研究表明β-catenin/USP1/EZH2信号调控轴的异常是导致神经胶质瘤形成的关键因素。

研究背景

      Wnt/β-catenin信号途径高度保守，在动物胚胎发育、器官形成等生理过程中都发挥重要作用。该信号由Wnt配体结合后激发，导致Frizzled和LRP受体共同激活，接着β-catenin入核与转录因子TCF/LEF结合，从而激活下游基因表达。在多种癌症中都有发现过度激活的β-catenin信号。异常的β-catenin激活在胶质母细胞瘤中普遍存在，是该肿瘤发生的关键，但这种异常激活导致肿瘤形成的隐藏机制还未得到完全揭示。

      EZH2是PcG（Polycomb group）复合物的催化亚基，可介导组蛋白H3K27的三甲基化而参与特定基因的转录抑制。EZH2的过表达在胶质母细胞瘤中很常见，且与肿瘤的侵略性和晚期发展相关。EZH2的致癌作用很大程度上是通过介导H3K27三甲基化而导致表观遗传沉默，从而抑制下游肿瘤抑制基因的表达。EZH2可通过蛋白酶体泛素化途径被降解，研究发现多种E3连接酶可在不同生物学环境中介导EZH2的降解。

      本研究中，作者证明了β-catenin信号传导在EZH2调控中的关键作用。作者发现β-catenin会诱导USP1的表达，USP1与EZH2相互作用并使其去泛素化，从而防止EZH2被降解。因此被激活的β-catenin会使得EZH2处于稳定状态，从而抑制下游肿瘤抑制基因的表达，也促进了神经胶质瘤细胞的增殖和肿瘤的进展。本研究揭示的β-catenin–USP1-EZH2信号调控轴将超活化的β-catenin信号传导和EZH2介导的表观遗传基因沉默联系了起来，这是神经胶质瘤肿瘤发生的关键机制。

1. β-catenin通过抑制EZH2蛋白的泛素化而使其稳定
     为了研究β-catenin对EZH2表达的影响，作者检测了β-catenin野生型（β-catenin+/+）和敲除（β-catenin-/-）的MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）中的EZH2蛋白水平。结果发现与β-catenin+/+相比，β-catenin-/-中EZH2蛋白水平下降，也导致其中的组蛋白H3K27me3水平降低。作者发现，在SW1783和正常人星形胶质细胞中，持续激活的β-catenin–S33Y突变体的过表达上调了EZH2蛋白水平。使用β-catenin siRNA在患者的GSC11细胞中进行的实验进一步证实了这一结果。但是，β-catenin对EZH2 mRNA水平没有明显影响，这表明β-catenin调控了EZH2转录后的表达。
       为了探究β-catenin是否可以调控EZH2蛋白的稳定性，作者检测了经过环己酰亚胺处理的β-catenin+/+和β-catenin-/-MEF中EZH2的丰度。结果发现，在缺失β-catenin的情况下，EZH2的稳定性大大降低，而持续激活的β-catenin–S33Y的过表达促进了EZH2蛋白的稳定性。接着作者又研究了β-catenin对EZH2泛素化的影响，结果表明β-catenin–S33Y的过表达可以抑制SW1783细胞中EZH2的泛素化而使其不被降解。
研究结论：β-Catenin可以抑制EZH2的泛素化，从而维持其蛋白稳定。

2. USP1可以稳定胶质母细胞瘤细胞中的EZH2蛋白
      作为泛素化的反向过程，蛋白质去泛素对于调控蛋白质循环十分关键。为鉴定出EZH2的去泛素化酶（DUB），作者筛选了23个在原癌基因或中枢神经系统中高表达的DUB。作者用环己酰亚胺处理HEK293T，结果发现去泛素化酶USP1，USP11，USP16和USP29会上调EZH2蛋白的水平。接着作者又进一步研究了这些DUBs对EZH2泛素化的影响。结果发现，四个DUB中只有USP1显著降低了EZH2蛋白的泛素化水平，这表明USP1可以充当EZH2的去泛素化酶。
      接下来，作者评估了USP1对EZH2蛋白稳定性的影响。通过蛋白质印迹结果可知，U87MG和GSC11细胞中USP1的敲低导致了EZH2蛋白水平的下降。免疫荧光染色实验发现，HEK293T和SW1783细胞中USP1过表达显著上调了EZH2蛋白水平，而USP1缺失的细胞中EZH2几乎消失。但是，USP1对EZH2 mRNA水平没有影响。与此结果一致的是，在神经胶质瘤细胞系中，EZH2的表达与USP1的表达呈正相关。
研究结论：USP1可以调控胶质母细胞瘤细胞中的EZH2蛋白水平使其维持稳定。
3. USP1与EZH2直接相互作用并使其去泛素化

      接下来，作者检测了USP1和EZH2之间的相互作用。免疫共沉淀结果显示，在过表达USP1与EZH2两种蛋白的HEK293T细胞中此二蛋白有相互作用。此外，内源性USP1和EZH2在U87MG和GSC11细胞中有相互作用。为了定位EZH2中相互作用的蛋白质区域，作者构建了表达一系列EZH2缺失突变体的质粒，结果发现EZH2的SANT结构域的第310-484位残基是其与USP1相互作用所必需的。
      作者接下来评估了USP1对EZH2泛素化的影响。野生型USP1的过表达显著降低了EZH2的泛素化，进一步表达WDR48（一种增强USP1活性的USP1结合伴侣分子）增强了这种作用。但是，仅WDR48的过表达并不能显著降低内源性EZH2的泛素化。另外，使用两个独立的shRNA敲低内源性USP1会促进GSC11和U87MG细胞中的EZH2泛素化。为研究USP1是否直接去泛素化EZH2的问题，作者从HEK293T细胞中纯化泛素化的EZH2，并与USP1和WDR48蛋白一起孵育。结果显示USP1/WDR48抑制了EZH2泛素化，并且抑制效率随着体系中的USP1/WDR48蛋白量的增加而提高。
研究结论：USP1直接与EZH2发生蛋白相互作用，并通过去泛素化发挥调控作用。

4. β-catenin通过激活USP1转录促进EZH2的稳定性

      为探究USP1的表达是否受β-catenin调节，作者首先利用癌症基因组图谱（TCGA）数据调查了胶质母细胞瘤中β-catenin、TCF4和USP1的mRNA表达水平。作者发现胶质母细胞瘤中USP1的mRNA分别与β-catenin和TCF4的mRNA水平线性相关，且在所有亚型中都观察到β-catenin与USP1表达水平的线性相关性。作者还发现，β-catenin-S33Y的转染显著提高了SW1783和NHA细胞中USP1的mRNA水平，而β-catenin-/-MEF中USP1的mRNA水平下降。这些结果均表明，β-catenin激活了USP1的转录。
      接着，作者搜索了USP1的启动子区域，发现了一个潜在的LEF/TCF结合序列，这个序列位于转录起始点上游2,000 bp附近。另外，ChIP分析表明，在Wnt3a处理条件下，β-catenin与USP1启动子区域结合并且结合能力增强。为了进一步确定β-catenin对USP1的转录调控，作者构建了两个USP1启动子报告基因Pro-L和Pro-S，其中Pro-S缺少上游TCF4结合元件。报告基因检测显示，与Pro-S相比，Pro-L对Wnt3a和β-catenin信号的反应更大。
      作者进一步评估了β-catenin对USP1和EZH2蛋白表达的影响。结果显示，不同神经胶质瘤细胞系中β-catenin的表达均与USP1和EZH2呈正相关。在Wnt3a处理下，SW1783和NHA细胞中USP1和EZH2表达水平均有上调，而使用shRNA敲低U87MG细胞中的β-catenin可显著下调USP1和EZH2蛋白的表达。此外，β-catenin-/-MEF中的EZH2表达水平降低，而在β-catenin-/-MEF中过表达USP1可使得EZH2水平恢复。
研究结论：β-catenin激活USP1的转录，从而促进神经胶质瘤中EZH2蛋白的表达。
5. USP1稳定EZH2蛋白会使下游基因表达被抑制

      通过催化组蛋白H3K27me3的形成，EZH2可以抑制一系列与胶质母细胞瘤致瘤特性相关的抑癌基因，包括CDKN1B，RUNX3和HOXA5。因此，作者评估了USP1对EZH2介导基因表达的影响。结果发现，USP1的敲低显著降低了CDKN1B，RUNX3和HOXA5的启动子对EZH2的招募效果，这也导致了H3K27me3水平降低。然后，作者检测了在β-catenin/USP1/EZH2中EZH2的靶基因的mRNA丰度。结果发现，在GSC11细胞中，敲低β-catenin/USP1/EZH2可以上调这些基因的mRNA与蛋白水平。
      为了进一步研究USP1-EZH2信号轴对靶蛋白表达的影响，作者构建了一个EZH2变体ND-EZH2（不可降解的EZH2），该变体可抵抗蛋白酶体介导的蛋白降解。考虑到EZH2的421残基位于与USP1相互作用的310-484区域内，USP1可能是通过逆转EZH2泛素化来稳定EZH2。实验结果显示，过表达ND-EZH2可以抵消USP1敲低对RUNX3，HOXA5和p27表达水平的影响。
研究结论：USP1通过稳定EZH2来促进EZH2介导的对下游基因表达的抑制。
6. β-catenin/USP1/EZH2信号调控轴促进神经胶质瘤的形成
       作者进一步研究β-catenin–USP1-EZH2信号轴在神经胶质瘤细胞增殖和肿瘤发生中的作用。实验发现，β-catenin/USP1/EZH2在GSC11细胞中的敲低显著抑制了细胞增殖，并且ND-EZH2的过表达几乎完全逆转USP1敲低造成的影响。接着作者又探索确定β-catenin/USP1/EZH2对细胞增殖的影响是否是由细胞周期分布的变化引起。结果显示，SW1783细胞中Wnt3a的过量生产显著降低G0–G1期细胞比例，并增加了G2–M期细胞比例。USP1敲低抵消了这种效应，而ND-EZH2的重组表达可以恢复这种效应。
      为研究β-catenin–USP1-EZH2信号轴在体内肿瘤形成中的作用，作者将神经胶质瘤细胞颅内注射到裸鼠中。结果显示，源自低级神经胶质瘤的SW1783细胞没有在裸鼠中形成肿瘤，但Wnt3a在细胞中的过表达显著促进了肿瘤的生长，并且USP1/EZH2的敲低大大抑制了这种作用。这表明Wnt/β-catenin–USP1-EZH2信号轴可能在神经胶质瘤向胶质母细胞瘤的恶性转变中起重要作用。

   接下来，作者评估了β-catenin/USP1/EZH2信号轴对神经胶质瘤小鼠存活的影响。与对照组相比，SW1783细胞中Wnt3a的过表达缩短了受植入小鼠的存活时间，而敲低USP1/EZH2消除了这种效应。此外，β-catenin/USP1/EZH2的敲低显著延长了GSC11胶质母细胞瘤小鼠的生存时间，而ND-EZH2的重组表达完全逆转了USP1敲低对小鼠存活的影响。
研究结论：β-catenin–USP1-EZH2信号轴在神经胶质瘤细胞增殖和肿瘤发生中起关键作用。

7. 神经胶质瘤患者样品中USP1表达的上调与β-catenin的激活和EZH2水平相关

       为确定研究的临床相关性，作者分析了30个II级和III级星形细胞瘤和50个胶质母细胞瘤标本切片的β-catenin/USP1/EZH2蛋白的表达。USP1的表达水平分别与核β-catenin和EZH2水平显著相关。接下来，作者评估了这些样本中核β-catenin、USP1和EZH2的表达水平是否与神经胶质瘤恶性程度相关。结果显示，胶质母细胞瘤中核β-catenin、USP1和EZH2的表达水平明显高于低级星形细胞瘤。从TCGA数据库的数据来看，较高的USP1 mRNA表达水平往往预示着神经胶质瘤患者的生存结果较差。
研究结论：β-catenin–USP1–EZH2信号轴在人类神经胶质瘤中起重要调控作用。