今天推荐的是由以色列海法理工学院生物系团队在2020年4月3日发表于EMBO Reports（IF：8.210，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Shenhav Cohen教授，研究表明长时间饥饿状态下，USP1通过介导Akt的去泛素化抑制PI3K-Akt级联信号转导。


      PI3K-Akt-FoxO-mTOR信号通路是控制所有细胞生长和代谢的中枢通路。IGF-I或胰岛素激活该通路可促进细胞分裂，相反，抑制这一途径会降低细胞存活率并导致肌肉萎缩。PI3K-Akt信号转导的核心是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，它是细胞表面受体传递生长和生存信号不可或缺的通道。Akt的失调会导致多种疾病，包括癌症、胰岛素抵抗和肌肉萎缩等。Akt的活性在细胞中受到严格调控，PDK-1和mTORC2激酶分别在T308和S473上磷酸化Akt。Akt在这些残基上的磷酸化被认为是限速的，也是最大程度激活Akt的必要条件。另一方面，Akt磷酸化之前的泛素化调控也是PI3K-Akt活性所必需的。
      USP1是半胱氨酸蛋白酶USP家族的一员，它通过去泛素化作用来逆转蛋白修饰。USP1最具特色的功能是在细胞核中作为DNA损伤应答的调节因子，并作为某些转录因子的负调节因子阻止细胞分化。最近的研究表明，USP1还能通过促进胰腺β细胞的凋亡在糖尿病中起作用。此前发现一种USP1基因敲除的小鼠有多种发育缺陷，包括骨质减少、围产期致死、雄性不育、染色体不稳定和Fanconi贫血。虽然USP1在DNA修复机制中的重要作用已被充分证明，但其在调节代谢和生长方面的确切功能尚不清楚。


  研究发现，去泛素化酶USP1可以去除Akt激酶上K63连接的多泛素链，从而抑制长时间饥饿时小鼠肌肉中的PI3K-Akt-FoxO信号。作者通过DUB筛选平台确定了USP1是Akt的直接DUB。研究表明，小鼠肌肉中USP1的缺失促进了禁食期间Akt的泛素化、PI3K-Akt-FoxO信号转导以及葡萄糖摄取。作者通过免疫共沉淀和质谱鉴定出Dab2、TSC1/TSC2和PHLPP1为USP1的结合蛋白。饥饿状态下，Dab2对于USP1-TSC1-PHLPP1复合物募集Akt以及抑制PI3K-Akt-FoxO信号至关重要。此外，USP1通过限制TSC1水平以维持mTOR介导的基础蛋白合成速率，从而维持其自身的蛋白水平。作者认为，当细胞能量水平较低时，Dab2可以招募Akt到USP1-TSC1-PHLPP1复合物中，从而有效终止生长信号的传递。

1. USP1是Akt的去泛素化酶
      作者通过免疫印迹法对喂食和禁食（2d）小鼠的骨骼肌提取物进行分析，结果发现Akt在正常条件下处于泛素化状态，但在禁食期间其泛素化水平降低，而未经修饰的Akt累积。这表明，Akt在禁食期间被去泛素化。
      接着作者从正常肌肉匀浆中免疫沉淀Akt，并将沉淀加入含有活性DUB阵列的DUB筛选板。结果显示，USP1/UAF1、USP11、OTUB2、OTUD5（p177S）和OTUD6A这五个DUBs切断了Akt上的多泛素链并降低其泛素化水平。其中，USP1优先去除K63连接的泛素链，这是Akt激活所必需的多泛素化类型。
      为探究USP1是否能在体内将Akt去泛素化，作者分析了禁食期间USP1敲低对Akt泛素化的影响。结果显示，USP1的下调抑制了Akt泛素化水平的降低，相反，Akt以泛素化形式累积。当作者将USP1（C90S）质粒导入细胞来抑制USP1功能时，也得到了类似的结果。进一步的研究表明，K63泛素化的Akt可能在禁食期间增加，而USP1催化该蛋白的去泛素化。
      为确定USP1是否切割Akt的K8-泛素链，作者将shLacz（对照）或HA-Akt（K8R）质粒与USP1（C90S）共转导入肌肉中以引起泛素化Akt的积聚。结果发现，禁食2d时，HA-Akt（K8R）显示出有限的泛素化，远低于仅表达USP1（C90S）的内源性Akt的泛素化水平。这些表明，在禁食期间抑制USP1会使得Akt在K8上发生泛素化。

图1. USP1是体内作用于Akt的去泛素化酶

研究结论：USP1在体内对Akt的去泛素化至关重要，并且这很可能导致PI3K-Akt信号的抑制。
2. USP1介导的去泛素化抑制了Akt在T308的磷酸化以及PI3K-Akt-Foxo信号转导
     作者发现，小鼠禁食2天后，胰岛素受体、Akt及其靶点FoxO3和GSK3b的磷酸化水平显著降低。然而，抑制USP1几乎完全阻断了这种现象。事实上，Akt（T308）、FoxO3和GSK3b的磷酸化水平在抑制USP1后与喂食小鼠相似。此外，尽管Akt的泛素化可以促进其在T308和S473的磷酸化，但在USP1被抑制而泛素化的Akt累积的肌肉中，Akt在S473的磷酸化水平仍然较低。
      通常在禁食期间，FoxO被激活并刺激萎缩基因的表达，包括MuRF1和Atrogin 1。作者发现，通过shRNA（shUSP1）下调USP1会导致MuRF1和Atrogin1表达显著降低。实验表明，相对于喂食小鼠，禁食小鼠的平均重量减少了31%，但USP1的下调明显减轻了这种消耗。另外，通过注射ML323特异性抑制USP1可显著改善小鼠的糖耐量，并在禁食期间激活PI3K-Akt-FoxO信号通路。

图2. USP1对Akt的去泛素化使其在T308的磷酸化和PI3K-Akt-FoxO信号转导降低

研究结论：USP1的功能是使PI3K-Akt-FoxO信号在禁食期间减少的关键，而这导致葡萄糖摄取和蛋白质合成降低、FoxO介导萎缩基因表达以及肌肉萎缩。
3. Ser/Thr磷酸酶PHLPP1在禁食期间抑制Akt在S473的磷酸化
      先前的研究表明，Ser/Thr蛋白磷酸酶PHLPP1能使Akt在S473发生去磷酸化。作者将特定的shRNA（shPHLPP1）导入小鼠TA肌肉来下调PHLPP1水平。结果发现，PHLPP1的降低导致磷酸化的Akt（S473）和S6K（T389）增加，而磷酸化的Akt（T308）保持在较低水平。与Akt和S6K的磷酸化增加一致，PHLPP1下调也促进了蛋白质合成。这种蛋白质合成的增强可以解释在表达shPHLPP1的纤维中观察到的肌肉萎缩被显著抑制的现象。作者还在喂食小鼠的肌肉中发现，PHLPP1和UAF1可与USP1共沉淀。

研究结论：禁食期间，PHLPP1介导Akt在S473去磷酸化，其可能与USP1共同发挥作用，从而有效抑制Akt和PI3K-Akt-mTOR信号传导。
4. 禁食时Akt被招募至USP1-PHLPP1复合物中
     作者通过免疫沉淀和质谱研究与Akt相互作用的组分，即PHLPP1、USP1及其辅助因子UAF1和FoxO3。质谱分析显示，只有29种蛋白是这四个组分的共同结合物，包括TSC1/TSC2复合物以及可抑制上皮细胞增殖的Dab2。
    喂食小鼠肌肉匀浆的甘油梯度分级表明，TSC1、TSC2、USP1/UAF1和PHLPP1沉淀到相同组分中，而Akt在这些组分中几乎不存在。进一步研究表明，在禁食期间，Akt转移到含有USP1/UAF1、TSC1/TSC2和PHLPP1的较重组分中，此时的Akt在T308的磷酸化水平降低。
      免疫沉淀实验显示，TSC2、USP1和PHLPP1可与TSC1共沉淀。研究表明，在禁食期间，USP1通过结合UAF1而被激活，并且招募Akt。然而，作者发现USP1与UAF1的结合并不是招募Akt所必需的，因为即使USP1/UAF1的结合受到干扰，Akt仍然可与USP1结合。
      作者发现，在禁食期间，当Akt被抑制时，USP1通过影响TSC1提高蛋白质合成速率。TSC1在USP1被抑制时的积累并不是由于其基因表达增加，研究表明，USP1通过促进TSC1的降解来限制其含量。此外作者发现，在饥饿和非饥饿肌管中，USP1的下调均能导致泛素化TSC1的积累、Akt磷酸化水平升高以及S6K磷酸化水平降低。这表明正常情况下，USP1也调节PI3K-Akt信号和TSC1的稳定性。

研究结论：当PI3K-Akt信号强度较低时，USP1通过限制TSC1以促进蛋白质合成速率，并维持自身蛋白水平。USP1的下调会导致TSC1累积，并且USP1对TSC1的作用与其抑制Akt活性的作用无关。
5. Dab2促进USP1-PHLPP1-TSC1复合物招募Akt
     为探究Dab2是否影响禁食期间的PI3K-Akt信号活性，作者使用Dab2-DN载体作为Dab2-Akt结合的抑制剂。实验结果显示，在禁食期间，Akt与USP1、TSC1的结合增强。类似地，Dab2与该蛋白复合体的结合也在禁食时增加。研究发现，抑制Dab2-Akt的结合可以阻止Akt和Dab2被募集到USP1复合物中，这表明，Dab2在其中起作用并促进USP1招募Akt。
      为了确定Dab2是否促进Akt去泛素化，作者在喂食和禁食小鼠的肌肉中免疫沉淀Akt，并通过SDS–PAGE和免疫印迹分析。结果显示，在禁食状态下，Akt的高分子量泛素化形态减少。而Dab2功能的抑制导致高分子量K63连接的泛素结合物在Akt上累积。因此，Akt的去泛素化依赖于Dab2的功能。

研究结论：Dab2对于禁食状态下USP1诱导的Akt泛素化的减少以及由此产生的Akt和PI3K-Akt-FoxO信号的抑制至关重要。