研究背景：

      乳腺管癌是0阶段的乳腺癌由异常增殖的表皮细胞侵入乳腺管而形成。有些病人不会进一步诱导发送恶性乳腺癌，但是临床上很难预测哪些病人会进一步恶化为乳腺癌。因此，病人被诊断为乳腺管癌是通常会接受过度的治疗。

而且，目前为止只有两株商业化的细胞系用于研究原位乳腺管癌：SUM225CWNa和MCF10DCIS.COM。所以，作者利用最近报道的条件性重编程技术体外培养临床上获得的原位乳腺管癌样品。

实验数据：

一. WCRC-PM-20培养物在第7天形成细胞群落

作者将临床获得原位乳腺管癌样品（DCIS）进行体外条件性重编程培养（图1）。培养7天后，DCIS细胞形成细胞群落，类似鹅卵石形的表皮细胞（图1A-C）。并且能够看到层纤维细胞分散在培养瓶里（图1B）。此外，在体外培养的细胞中能看到其他不同形态的分离的细胞（图1E），表明该培养条件能够维持样品中细胞的多样性。

二. 原位人类乳腺管癌培养物不同代数的比较

作者将同一病人的细胞培养不同的代数进行比较（图2）.通过对比，作者发现不同病人的细胞在心态学上是有微小差异的（图1f和2a）。当对比同一个病人不同代数的细胞，作者发现其中细胞形态大，不增殖的细胞随着细胞穿的代数增加而增加（图2B）。通过对DCIS细胞的培养，作者发现所有细胞最终都会停止生长。在这些细胞培养物中，WCRC-PM-20呈现出持续增长的态势，而WCRC-PM-18培养一周后就停止增长了（图2C）。

三. EpCAM标记的原位乳腺管癌类器官细胞群的免疫化学分析

EpCAM是乳腺管腔上皮细胞上粘附因子的一个标志分子。作者将两个病人的样品培养后利用免疫荧光进行分子生物学鉴定。通过免疫荧光染色EpCAM分子（图3A-E），发现虽然整个细胞群落是EpCAM阳性的（图3A-D），但是当把图像放大（图3E），发现有些细胞表达极低或者不表达EpCAM。这表面体外培养仍然保持了样本的异质性。另外，作者通过染色K8（乳腺管腔表皮细胞），K14（乳腺基底表皮细胞），发现原代培养的DCIS是同时包含乳腺管腔表皮细胞和乳腺基底表皮细胞的。

四. 原位乳腺管癌培养物在第二天后丢失ERa的表达

原位乳腺管癌细胞体外培养的最大挑战就是雌激素受体（ER）的丢失。作者通过比对未培养的原代乳腺管癌细胞（图4A）和培养两天后的乳腺管癌细胞（图4B），发现体外培养两天后，雌激素受体消失。

五. 免疫组化分析F培养基和含有ROCK抑制剂的条件性基中培养的DCIS细胞

作者将不同病人样品进行体外培养，其中一组是条件性培养基加ROCK抑制剂；另外一组是F培养基不含ROCK抑制剂。MCF7是乳腺管腔细胞，MCF10A是乳腺基底细胞，（图5D，H，L，P）MCF7细胞系和MCF10A细胞系1:1混合培养作为对照。通过荧光染色K8和K14，发现原代乳腺管癌细胞是同时包含乳腺基底细胞和管腔细胞，这与报道相符合（图5A-C）。通过对比在条件性重编程培养基和F培养基中培养的细胞，作者发现条件性重编程培养只是让细胞具有增殖能力而没有改变样品中不同细胞群的比例，并且在条件性培养基下，各细胞保持细胞形态小，具有增殖能力（图5A-C，I-K）；在F培养基条件下，细胞形态变得大而扁平失去增殖能力（图5E-G，M-O）。

六. 细胞在100%密度下培养2周的免疫荧光分析

肿瘤细胞一般会不会出现接触抑制的情况。为此，作者希望验证体外培养的DCIS细胞是否存在接触抑制。作者将细胞以100%的密度铺到F培养基和条件性培养基中进行培养两周，然后将细胞固定进行免疫荧光染色（图6）。作者发现所有DCIS培养的细胞都出现接触抑制。在细胞100%密度的情况下，细胞培养若干天后，出现环形岛状细胞团，并有一层细胞薄薄的围在外周（图6D，H，L）。

通过免疫荧光染色发现，中间环形岛状细胞是K8阳性的管腔细胞；而外周包围的细胞是K14阳性的基底细胞（图6A-C）。分析边界细胞时发现，这类细胞同时表达K8和K14（图E-L），作者认为是两群细胞叠在一起的结果。并在某些情况下，基底细胞能够爬到管腔细胞的上面（图6E-H）。综合这些结果，表明DCIS培养中同时包含乳腺基底细胞和乳腺管腔细胞，并且能够自发的重排成基底、管腔细胞的比邻结构。

讨论与总结：

鉴于目前只有两株商业化乳腺管癌细胞系可供研究可用，而且其不能很好的重现原代肿瘤细胞的特性，所以，作者利用条件性重编程培养技术进行体外培养病人的DCIS细胞。通过这个方法，可以快速体外扩增DCIS细胞。虽然，这个方法培养能够有效的保持细胞的异质性，但是随着培养的时间增加，出现越来越多的细胞形态大，不增殖的细胞。