想发高分文章?或许可以试下这个研究思路,赶紧学习下---厦门安提海拉生物科技有限公司

技术资料 TECHNICAL DATA

当前位置：首页--技术资料--技术资料

想发高分文章?或许可以试下这个研究思路,赶紧学习下

发布时间：2021-09-08 [返回]

还在为发文章而苦恼吗，还在为没有研究方向而彻夜难眠吗？再也不必焦虑了，安提海拉生物为您推出一整套去泛素化酶DUBs研究思路，为您的科研之路保驾护航！
什么是DUBs？去泛素化酶（DUBs），是一类数量很大的同工酶。它主要通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或异肽键，将泛素分子特异性的从连接有泛素的蛋白质或者前体蛋白上水解下来。去泛素化酶包括7类不同的家族，泛素特异性蛋白酶（USPs）、泛素羧基末端水解酶（UCHs）、Machado-Josephin结构域蛋白酶（MJDS）、卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTU）、MPN(+)/JAMM金属蛋白酶、含序列与泛素分子结合的新DUB家族蛋白酶（MINDYs）以及结合泛素肽酶1的锌指（ZUP1），如图1所示。

图1. DUBs系统进化树

DUBs如何调控生物学功能？体内蛋白在翻译之后，还要经过不同程度的修饰(如泛素化、磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化等)才能发挥所需的功能，这种翻译后修饰过程受到一系列修饰酶和去修饰酶的严格控制，而DUBs是一类与蛋白泛素化相关的酶，它们在体内发挥功能，离不开一个关键分子，那就是泛素。泛素是一种由76个氨基酸组成，分子量大约为8.45kDa的蛋白质，如图2所示，泛素在ATP的作用下被泛素激活酶E1激活，然后被转移到泛素结合酶E2上，泛素连接酶E3同时结合E2和靶蛋白，最后泛素被转移到靶蛋白上。结合泛素的靶蛋白就会被26s蛋白酶体识别并降解。那么，DUBs是如何在这个过程中发挥作用呢？如图2所示，DUBs的底物是带有泛素分子的靶蛋白，DUBs通过水解作用可以去除靶蛋白上的泛素分子，从而抑制靶蛋白的降解，提高蛋白稳定性。

图2. 泛素化与去泛素化调控

为什么研究DUBs？细胞内的蛋白水平始终处于动态调控之中，蛋白的稳定性调控对于维持生物体细胞内各个生理过程的正常进行具有重要意义。如图3所示，游离的氨基酸分子能够合成蛋白质，而已合成的蛋白质在一定条件下又被降解为游离的氨基酸分子，这样细胞内就形成了蛋白质合成和降解的动态平衡，不仅可以促进细胞内各个生理过程的正常进行，还对细胞内物质的有效循环利用具有重要意义。

图3. 蛋白质动态平衡

研究表明，DUBs在包括细胞生长，细胞增殖，成骨分化，细胞周期，脂类运输等多种生物学过程中发挥着关键的调控作用，其表达失调与多种疾病的发生发展有着密不可分的关系，包括癌症，免疫系统疾病，心血管疾病等等。近年来，DUBs逐渐成为大家关注的热点，如图4所示，可以发现，从PubMed上搜索得到的DUBs相关文章，其数量呈现逐年增多的趋势。越来越多人已经开始研究DUBs，你还在等什么？

图4. PubMed报道的DUBs相关文章统计

怎么研究DUBs？安提海拉生物拥有成熟的技术研发团队和先进的实验操作平台，并推出一系列DUBs相关研发产品。最关键的是，可以根据您的需求量身定制不同的DUBs研究思路。
首先，要从筛选特定DUB入手。DUB家族有很多蛋白，研究者要从这些蛋白中通过某种成熟的筛选方法，找出适合研究的特定蛋白。这里为您总结了几种常用的DUB筛选方法，如图所示，DUB文库qPCR筛选（图5），DUB文库荧光筛选（图6），DUB文库WB筛选（图7）和DUB文库互作筛选（图8）。
其中，DUB文库qPCR筛选（图5）是最简单且方便的方法，可以选用这种方法先筛选出在某种癌症或者疾病过程中存在差异表达的DUB，在细胞中过表达差异的DUB，使用Co-IP实验富集产物，经过质谱分析寻找互作的靶蛋白。

图5. DUB文库qPCR筛选

其次，当您已经有要研究的靶蛋白时，那么DUB文库荧光筛选（图6）将会是一个最迅速而又高效的选择，通过构建靶蛋白与Luc&GFP融合蛋白的稳转细胞株，转染DUB过表达/敲减文库，再使用生物化学发光仪检测靶蛋白的荧光值，就可以锁定调控靶蛋白水平的DUB。

图6. DUB文库荧光筛选

接着，在已经明确靶蛋白的情况下，您也可以选择目前比较常用的DUB文库WB筛选方法（图7），这种方法不需要特殊的仪器，单纯的WB实验就可以轻松搞定筛选，最终确定DUB。

图7. DUB文库WB筛选

此外，还为您推荐一种最直接的筛选方法，那就是DUB文库互作筛选（图8），这种方法相对于上述其它方法而言，比较挑战研究者的实验技能，但依然有不少研究者热衷，因为它是以蛋白-蛋白相互作用为切入点，这是DUB调控靶蛋白稳定性的前提条件，因此也是一种很不错的选择。

图8. DUB文库互作筛选

最后，筛选告一段落，DUB调控机制的研究思路马上就要跟大家见面啦！

首先，我们知道，生物体内的修饰酶和去修饰酶在催化底物的时候，要先跟底物结合。常用来研究蛋白-蛋白相互作用的方法包括免疫共沉淀（Co-IP）、GST-Pull down和免疫荧光（IF），综合这些方法，可以判定DUB在体内和体外与靶蛋白的相互作用，如图9所示。

图9. DUB与靶蛋白相互作用

其次，DUB与靶蛋白发生相互作用之后，会改变靶蛋白的泛素化修饰，让原本已经被泛素化的靶蛋白，重新去泛素化。因此，在研究DUB调控机制的设计思路中，体内/体外的泛素化调控实验也是必不可少的，如图10所示。

图10. DUB对靶蛋白的泛素化调控

接着，DUB的去泛素化调控必然会影响靶蛋白的稳定性，目前常用的探究靶蛋白稳定性的是半衰期实验，在半衰期实验中，通过放线菌酮（CHX）处理，抑制总蛋白的合成，检测细胞内靶蛋白仅剩一半时所用的时间，以此来判断DUB对靶蛋白的稳定性调控，如图11所示。

图11. DUB对靶蛋白的稳定性调控

然后，就是大家比较关心的功能研究。DUB之所以重要，不仅仅是因为它调控了靶蛋白稳定性，更重要的是会影响细胞生物学功能，最终影响肿瘤或某一重大疾病的发生发展。在这个地方，一般研究的切入点就是先找到合适的信号通路，如PI3K-AKT信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、EMT信号通路及NF-κB信号通路等。很多高分文章显示，需要研究DUB通过调控靶蛋白来影响某一信号通路，以此强调靶蛋白回补DUB功能的重要性，如图12所示。